Der folgende Beitrag ist in transkript Nr. 11, 13. Jahrgang 2007 erschienen.

Kooperation von Eurofins Medigenomix und MWG Biotech AG:

Neue Software optimiert Sequenzen für Gensynthese

von Dr. Uwe Köhler und Dr. Tobias Wagner

Screenshot Geneius-Software

Der Bedarf an synthetisch hergestellten DNA-Fragmenten in der biologischen und pharmazeutischen F&E ist groß und nimmt stetig zu. Sowohl in der Industrie als auch in Forschungsinstituten wird zunehmend die Synthese von DNA-Fragmenten in die Hände von spezialisierten Serviceanbietern gelegt. Dies hat den Vorteil, dass Zeit und Kosten gespart sowie bestmöglichste Ausgangsprodukte für Experimente und Prozesse erhalten werden. Hochentwickelte Techniken und optimierte Verfahren ermöglichen eine schnelle, zuverlässige Synthese doppelsträngiger DNA-Sequenzen. Unabhängig davon, ob kürzere DNA Fragmente von z.B. 100 Basenpaaren, längere Gene mit mehreren tausend Basenpaaren oder kleinere Genome benötigt werden – die synthetischen Sequenzen werden zeit- und kosteneffizient und in höchster Qualität synthetisiert.

Sollen Gensequenzen, z.B. humanen Ursprungs, in heterologen Expressionssystemen wie E. coli eingesetzt werden, ist es notwendig, die zu synthetisierende Sequenz ausgehend von DNA- oder Aminosäure-Sequenzen vor Beginn der Synthese zu optimieren.

Der Gensynthese-Service der MWG Biotech AG beinhaltet standardmäßig diese Optimierung. MWG hat in Kooperation mit Eurofins Medigenomix speziell dafür eine ausgeklügelte Software neu entwickelt. Dabei wurde die langjährige Erfahrung in der Gensynthese für die Entwicklung neuer Algorithmen zur Optimierung von Sequenzen zugrundegelegt.

Das Ergebnis ist GENEius, eine intelligente Optimierungssoftware mit durchdachten Funktionen, die eine perfekte Anpassung von Sequenzen ermöglicht. Ein großer Vorteil von GENEius ist die automatische Adaption der Codon-Usage, z.B. um DNA-Sequenzen für die Protein-Expression in einem Wirtsorganismus anzupassen. Wissenschaftler, die cDNAs in heterologen Expressionssystemen exprimieren, beobachten oft geringe Expressionsraten. Ein Grund dafür kann sein, dass sich die Codon-Präferenz von Art zu Art stark unterscheidet, obwohl der genetische Code weitgehend für alle Organismen gleich ist. Da 61 Tripletts für nur 20 Aminosäuren codieren, werden die meisten Aminosäuren durch 2, 3, 4 oder sogar 6 Tripletts codiert. Das führt zu unterschiedlichen Frequenzen von Codons in verschiedenen Organismen. So werden z.B. die für Arginin codierenden Codons AGG und AGA beim Menschen mit einer Frequenz von je 21% integriert, während sie in E. coli mit einer Frequenz von lediglich 2% bzw. 4% eingesetzt werden. Wird ein menschliches Gen in ein E. coli-Expressionssystem eingeschleust, werden die tRNAs der Codons AGG und AGA zu schnell verbraucht, und die Expressionsrate wird voraussichtlich sehr niedrig sein.

Anpassung der Codon Usage

Die GENEius-Software der MWG verwendet Protein- oder DNA-Sequenzen als Ausgangsbasis und passt die codierende Sequenz exakt an die Codon-Usage eines frei wählbaren Organismus an. Das Ergebnis nach mehreren Optimierungsrunden ist eine zum natürlichen Vorkommen nahezu identische Codon-Frequenz. Außerdem ist es möglich, bestimmte Codons mit geringer Frequenz auszuschließen oder nur ein Codon je Aminosäure auszuwählen.

Ein weiterer Vorteil von GENEius ist das Vermeiden direkter oder invertierter Repeats und Hairpin-Strukturen in der optimierten Sequenz, die bei der Transkription und Translation stören könnten. Zudem ermöglicht GENEius die gleichmäßige Verteilung des GC-Gehalts, wodurch ebenfalls die Effizienz der Transkription und Translation verbessert wird.

Ist ein synthetisches DNA-Fragment hergestellt, soll es meist in einen geeigneten (Expressions-) Vektor subkloniert werden, wofür singuläre Schnittstellen (Sites) notwendig sind. Mit GENEius können multiple Schnittstellen in der optimierten Sequenz vermieden werden, um die Einmaligkeit der 5’- und 3’-Klonierungs-Sites zu gewährleisten. Andere individuelle Motive, wie Spleiß-Donor- und Akzeptorstellen oder Bindungsstellen für Transkriptionsfaktoren, können zur Liste der "Bad Motifs" hinzugefügt und in der optimierten Sequenz vermieden werden. Anders als andere Optimierungsprogramme verringert GENEius die Qualität der Codon-Anpassung nicht, wenn die anderen Merkmale optimiert werden.

Eine weitere, sehr wichtige Eigenschaft von GENEius ist die Möglichkeit, Restriktions-Sites oder andere "Good Motifs" an bestimmten Positionen innerhalb der finalen DNA-Sequenz einzufügen. Die Software kann nach Aminosäuren-Strukturen in der Protein-Sequenz suchen, z.B um XhoI (CTC GAG) als Site einzufügen. Proteinsequenzen für NNC TCG AGN können LSS oder PSR sein. Treten LSS oder PSR in der Sequenz auf, kann daher eine XhoI-Site leicht an dieser Position eingefügt werden. Durch die Verwendung dieser Funktion können für Proteine kodierende Sequenzen
so gestaltet werden, dass singuläre Restriktions-Sites vorkommen. So können z.B. bestimmte Protein-Domänen aus dem neu synthetisierten Fragment einzeln weiter subkloniert werden.

Nach der Optimierung der Sequenz können mit GENEius weiterhin die optimalen Primer für die Gensynthese designt werden.

Informationen zur GENEius-Software gibt es unter www.GENEius.de, wo eine sogenannte "light"-Version der Software verfügbar ist. Die Vollversion wird exklusiv von den Wissenschaftlern der MWG für die Optimierung von Sequenzen für die Gensynthese verwendet.

Pressemeldung "MWG Biotech / Eurofins Medigenomix develop new software to optimize sequences for gene synthesis" öffnen (engl., pdf, 30 KB) >>